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Parâmetros de Validação Analítica| Pureza de pico (co-eluição)

Ao longo da sua validação analítica, muitos parâmetros serão avaliados com relação à adequabilidade do seu método para o seu produto. A maior discussão nesse meio é com relação à pureza de pico. Esperamos contribuir com a parte fundamental e teórica desse assunto nesse post.

Seu método é específico e seletivo?

O método é específico quando é capaz de:

  • Identificar o analito;
  • Fazer distinção entre suas diferentes formas; e
  • Fazer distinção entre ele e interferentes.

De acordo com a RDC 166/2017, seletividade do método analítico deve ser demonstrada por meio da capacidade de identificar ou quantificar o analito de interesse, inequivocamente, na presença de componentes que podem estar presentes na amostra, como impurezas e componentes da matriz.

Para isso, é fundamental identificar a presença de co-eluição, ou a pureza de pico cromatográfico.

Métodos de investigação da co-eluição na validação analítica

Existem muitas abordagens para a investigação de co-eluição, também chamada pureza de pico ou homogeneidade de pico cromatográfico. Mas só nos interessa a co-eluição que resulta de uma interferência no modo de detecção de um procedimento analítico.

Abordagens para investigação de pureza de pico:

  • Variações nas condições cromatográficas;
  • Análises de formato de pico;
  • Re-cromatografia de pico (frações);
  • Cálculo do software do equipamento com detector de rede de diodos (DAD);
  • Análise cromatográfica com detector de massa (MS), entre outros.

Mas cuidado! Somente é possível conseguir evidência da ausência da co-eluição, porém nunca prova da homogeneidade de pico.

De qualquer forma, a aplicação das abordagens citadas anteriormente, de preferência combinadas entre si, aumentam muito a confiabilidade do método.

Se outros métodos de detecção são aplicados, como diferentes comprimentos de onda no DAD ou MS, substâncias co-eluentes identificadas devem ser investigadas mais profundamente para determinar sua relevância sob condições de rotina. Para algumas das abordagens, como a variação nas condições cromatográficas, a relação com o desenvolvimento do método e a robustez é óbvia.

Por exemplo, cromatogramas obtidos da variação do pH, da composição do modificante, da temperatura, etc. podem ser inspecionados por novos picos, ou, alternativamente, os picos podem ser investigados por DAD ou MS.

1.Análise do Formato de Pico cromatográfico

Simples, direto e eficiente é a investigação visual de irregularidades no formato do pico, como formação de ombro ou assimetrias. Mas muitas vezes, em baixas concentrações, é muito difícil distinguir-se entre assimetrias e efeitos borrão na base dos picos mais largos ou efeitos de cauda. Estas inspeções visuais podem ser verificadas com cálculos matemáticos.

A primeira derivada do sinal resulta em curvas simétricas para picos Gaussianos. A co-eluição irá diminuir a altura do máximo ou do mínimo, dependendo se o tempo de retenção do pico que está co-eluindo é menor ou maior do que o do pico principal. O problema, porém, é que picos com caudas também produzem curvas de primeira derivada assimétricas, sem qualquer co-eluição. Nesses casos, a co-eluição é indicada por irregularidades ou ombros. Se a primeira derivada não pode ser dada pelo software do sistema cromatográfico, o cromatograma tem que ser exportado para o Excel e o cálculo da derivada tem que ser feito manualmente.

2.Re-cromatografia

A re-cromatografia de picos suspeitos é uma abordagem simples, sensível e imediatamente disponível para impurezas de baixa concentração que apresentarem co-eluição.

A confiança nos resultados é tanto maior quanto os dois métodos cromatográficos forem diferentes. Combinações variáveis podem ser levadas em consideração:

  • Variações nas condições do método (eluentes diferentes, tampão, pH, coluna);
  • Mudanças na metodologia: cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia iônica, cromatografia de camada delgada (TLC), eletroforese capitar, cromatografia gasosa, etc.

As investigações podem ser conduzidas  off-line com picos isolados ou frações de pico ou como acoplamento ortogonal direto dos dois métodos. Trabalhando com frações isoladas do pico, cuidados devem ser tomados para evitar substâncias advindas de degradações.

3.Detector de Rede de Diodos DAD

A homogeneidade espectral do pico cromatográfico pode ser investigada através de detectores DAD, desde que haja uma diferença entre o espectro e o tempo de retenção das substâncias co-eluentes. Se isto for constatado, detecção da co-eluição com softwares disponíveis no mercado é facilmente atingida, guardada somente a condição da diferença de concentração não ser muito grande. Entretanto, impurezas abaixo de 1% são normalmente difíceis de se detectar.

4. Cromatografia Líquida por detecção de massa LC-MS

A técnica mais poderosa de investigação de pureza de pico é a espectrometria de massas. Os espectros de massas são registrados sucessivamente sobre todo o intervalo de eluição do pico suspeito. Se durante a varredura desse espectro massas adicionais forem detectadas, o cromatograma de massas correspondente é extraído. Diferenças no tempo de retenção e/ou comportamento da eluição com respeito ao pico UV são prova da impureza co-eluente. Obviamente, o limite de detecção depende da resposta individual do espectro de massas da impureza. Para validar procedimentos de cromatografia líquida com tampão não volátil, a fração do pico correspondente pode ser isolado e a re-cromatografia pode ser realizada em condições compatíveis com espectrometria de massas. Quaisquer substâncias co-eluentes identificadas podem ser mais profundamente investigadas conforme sua relevância sob condições de teste de controle.

Por exemplo, uma impureza produzindo um pico grande no MS pode estar presente apenas em concentrações baixíssimas e desprezíveis. Hoje a detecção por massas não é usualmente utilizada na rotina da indústria farmacêutica. Como prós, ela oferece ganhos enormes de eficiência e confiabilidade nos procedimentos. Isso devido ao fato de oferecer detecções altamente específicas sem interferências, para o monitoramento e identificação de impurezas. Contra a técnica, temos seu alto custo e a necessidade de operadores extremamente qualificados na sua operação.

O cálculo de pureza de pico pode induzir ao erro de interpretação na validação analítica

Utilizar uma única fonte de análise gráfica para garantir a pureza cromatográfica ou a identificação espectral de uma substancia não é aconselhável. A ferramenta de pureza de pico deve ser considerada uma técnica instrumental auxiliar e não uma verdade absoluta! A incerteza analítica existe em todos os laboratórios químicos e experimentos ou técnicas instrumentais. O mais adequado é expressar o resultado associado a sua incerteza estatística. Esta afirmação aplica-se também à pureza de pico.

Seja nas avaliações da especificidade do método ou na pesquisa bibliográfica para a identificação de uma ou mais substâncias, a limitação do detector DAD está diretamente associada a resolução espectral, parâmetros de configuração do método de análise espectral e do limite da sensibilidade.

O detector de rede de diodos DAD não é seletivo, pois depende da faixa de comprimento de onda de trabalho. Somente compostos químicos com grupos de excitação na região UV-VIS são detectados, os conhecidos como grupos cromóforos. Compostos não detectados pelo DAD podem ficar “retidos” e enriquecidos na fase da coluna. Isso pode causar algum tipo de problema de separação e deformação do pico durante a sequência de análise ao longo do tempo ou pelo aumento da concentração da amostra.

Cromatografia + DAD é primariamente uma técnica de separação, mas não necessariamente uma técnica de identificação de substâncias.

A pureza de pico é na verdade um índice de similaridade. Dependendo do software cromatográfico, é expresso nas grandezas de 0 a 1, 0 a 100 ou 0 a 1000. Espectrogramas em várias regiões do pico são extraídos e comparados entre si na forma de uma correlação matemática. Um índice com valor mais alto significa que o sistema não encontrou diferenças significativas entre os espectros extraídos.

Se a intensidade do sinal for muito baixa, abaixo de 10 a 20mAU, o índice de similaridade pode ser expresso erroneamente para mais ou para menos.

Na faixa de 200 a 210 ou até 220nm pode ocorrer interferência de absorção do eluente. Isso depende do tipo de solvente ou reagente na fase móvel, e pode ocultar diferenças espectrais entre duas ou mais substancias co-eluidas. Correção de fundo de escala pode ser aplicável nestes casos.

Se dois picos estão presentes na mesma faixa de tempo de retenção ou apresentam baixa resolução de separação entre si, isso pode indicar a presença de duas substâncias com estruturas molecular muito semelhante (por exemplo, ativo e um sub-produto). Nestes casos, os espectros podem ser muito semelhantes e o índice de similaridade pode indicar 100%. Outro agravante é a baixa resolução espectral de detector ou a falta de ajuste adequado no método do DAD.

RECOMENDAMOS:

  1. Identificação de substâncias a partir de um padrão ou uma biblioteca: Associe o HPLC-DAD ao detector de massas ou espectrômetro de massas.
  2. Especificidade do método analítico: Associe os resultados do HPLC-DAD com as avaliações estatísticas de um software de Validação de Métodos (conheça o Software EffiValidation, em português!).

Fonte: Method Validation in Pharmaceutical Analysis.AGuide to Best Practice. Joachim Ermer, John H.McB. Miller (Eds.)

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