Blog

Validação Analítica| Precisão

Você conhece a diferença entre precisão, repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade? São muitas as dúvidas e poucos que realmente entendem os conceitos desse parâmetro fundamental de qualquer validação analítica. Você quer entender de forma didática e concisa? Então você vai gostar desse post.

Afinal o que é precisão?

De acordo com a definição do ICH:

“A precisão de um método analítico expressa a proximidade do acordo (grau de dispersão) entre uma série de medidas obtidas de múltiplas amostragens da mesma amostra homogênea sob condições predeterminadas. A precisão deve ser considerada em três níveis: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade.”

Então, de acordo com a definição do parâmetro, precisamos trabalhar com 3 ensaios para ter uma avaliação de precisão. Devemos fazer as análises de repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade.

Além disso, é importante que amostras originais sejam usadas nos ensaios, sempre que possível. Cada parâmetro estatístico será calculado individualmente para cada nível de precisão. Os parâmetros estatísticos mínimos são desvio padrão, desvio padrão relativo (coeficiente de variação) e o intervalo de confiança.

repetibilidade expressa a variabilidade analítica sob as mesmas condições de trabalho dentro de um curto intervalo de tempo. Pelo menos nove determinações cobrindo um intervalo específico ou seis determinações a 100% de concentração de teste devem ser realizadas.

precisão intermediária inclui a influência de efeitos aleatórios dentro dos laboratórios, de acordo com o uso pretendido do procedimento, por exemplo, diferentes dias, analistas ou equipamento, entre outros.

reprodutibilidade, isto é, a precisão inter-laboratorial, não é requerido para submissão da validação analítica, mas deve ser levada em consideração para padronização de procedimentos analíticos.

Níveis de Precisão

Quando se fala de um procedimento analítico, cada etapa contribui para a variabilidade total, de forma que a incerteza total é dada pela soma da contribuição de cada variável. Entretanto, esta abordagem (chamada bottom-up) é bastante complexa, não somente porque cada etapa deve ser levada em consideração, mas também sua variabilidade tem que ser conhecida ou determinada.

Alternativamente, a abordagem top-down, geralmente aplicada na análise farmacêutica, combina grupos de contribuições obtidas experimentalmente, isto é, os níveis de precisão. Essa abordagem holística é fácil de ser aplicada, porque cada uma das contribuições individuais não precisa ser especificamente conhecida. Porém, isto pode levar a interpretações e conclusões erradas se o analista não estiver ciente do nível correto das contribuições de cada etapa. Basicamente, as contribuições podem ser divididas entre contribuições de curto prazo e de longo prazo, com a precisão do sistema e repetibilidade pertencendo ao primeiro grupo, e a precisão intermediária e reprodutibilidade ao segundo. Cada um desses níveis inclui os níveis que estão abaixo dele.

Precisão do Sistema

A variabilidade da medida em si é abordada na determinação da precisão do sistema. Você encontra também nomeclaturas como precisão de instrumento, precisão de injeção, ou repetibilidade de injeção.

Repetibilidade de injeção não é muito didático, porque pode facilmente ser confundido com a repetibilidade real. É verdade que a contribuição do sistema de injeção na cromatografia líquida é normalmente dominante, especialmente em concentrações altas. Entretanto, existem contribuições adicionais da bomba (constância de fluxo de curto prazo, relevante para medidas de área de pico) e do processo de separação e da detecção/ integração. Por isso, o termo “precisão do sistema” é o melhor para descrever esse nível do que precisão de injeção.

A contribuição de variabilidade devido a flutuações de fluxo de curto prazo (bomba) pode ser separada da variação do sistema como um todo pela análise de mistura de substâncias.

Usando-se o teste de Maldener,  originalmente proposto para qualificação de equipamentos, subtrai-se a variação da área relativa de pico. Um exemplo é mostrado a seguir:

Realizando-se 10 injeções de uma mistura de ésteres metil, etil, propil e butil de ácido 4-hidroxibenzóico, precisões da área relativa do pico entre 0,04 e 0,12% foram obtidas. Isso corresponde a uma contribuição de erro da bomba entre 5 e 22% (em variância).

Quanto menor a precisão geral do sistema, maior será a importância dessa contribuição.

A precisão do sistema é obtida de análises repetidas da mesma amostra (solução). Pode ser calculado a partir da variância de um grande número de análises (pelo menos cinco), com um número suficiente de duplicatas. Apesar de infelizmente não ser descrito nas diretrizes do ICH, a precisão do sistema provê informação valiosa sobre a variabilidade do sistema analítico, principalmente do instrumento. Portanto, é um parâmetro importante para a qualificação do equipamento e para os testes de adequabilidade.

Atenção! Para refletir o desempenho do instrumento, a concentração do analito nessa avaliação precisa ser suficientemente acima do limite de quantificação (pelo menos 100 vezes). Caso contrário, os erros das contribuições de detecção/ integração irão aumentar.

Repetibilidade

A variabilidade de curto prazo inclui, somada à precisão do sistema, as contribuições de preparação de amostra, como pesagem, pipetagem, diluição, extração, homogeneização, etc.

Portanto, é essencial se aplicar o procedimento analítico inteiro (como descrito na metodologia proposta), ao invés  de meramente realizar a injeção da mesma amostra seis vezes. Esta também é a razão para o uso de amostras originais, porque só então o procedimento analítico pode ser realizado exatamente como a aplicação de rotina.

Podem haver exceções, mas estas devem ser demonstradas ou cautelosamente justificadas.

Por exemplo, degradantes a serem analisados perto do limite de quantificação, onde a contribuição das variâncias na preparação de amostra pode ser desprezada, a precisão do sistema e repetibilidade são idênticas.

Em alguns casos, amostras contaminadas podem ser utilizadas. Nesses casos, também é permitido que diversos parâmetros de validação (como linearidade, precisão e exatidão) possam ser avaliadas simultaneamente. Essas aplicações podem ser:

  • No início do desenvolvimento da metodologia, onde a precisão é menos crítica;
  • Quando a variabilidade exige só uma pequena parte do intervalo da especificação (menos que aproximadamente 10%);
  • A quantidade de impurezas esperada está longe do limite de especificação.

Uma pergunta muito frequente é: quantas amostras ou preparações em duplicatas são necessárias para a análise de repetibilidade?

A resposta é: depende do modelo estatístico escolhido. A repetibilidade pode ser calculada usando-se um grande número de amostras preparadas, mantendo-se um mínimo de seis. Alternativamente, um número suficiente de preparações em duplicata pode ser usado.

Os cálculos não devem ser realizados para um número menor de dados devido à grande incerteza envolvida.

O desvio padrão verdadeiro pode ser até 4,4 vezes maior que o resultado obtido de três determinações!

Um cálculo estatístico confiável dos parâmetros de validação é um fator decisivo para uma validação confiável. A DCtech oferece um software específico para validação analítica em laboratórios. O Effivalidation é certificado pela ISO 17025/2017 (e portanto pela RDC 166/2017 da Anvisa). Possui diversos com modelos estatísticos disponíveis. O software também tem a vantagem de estar disponível em português. Veja no vídeo abaixo uma demonstração do software para o parâmetro precisão.

O Effivalidation pode te ajuda00r no cálculo da precisão conforme a RDC 166/2017.


Continue lendo sobre precisão intermediária e a reprodutibilidade.

Fonte: Method Validation in Pharmaceutical Analysis. A Guide to Best Practice. Joachim Ermer, John H.McB. Miller (Eds.)


Artigos relacionados:

ANVISA, Effivalidation, Parâmetros da validação analítica, Precisão, Software , , , , , , ,