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Aplicação HPLC | Comparação de Compostos em Extrato de Baunilha e Sabor de Baunilha

Esta nota de aplicação apresenta um método de gradiente usando uma coluna de núcleo sólido para a determinação de diversas substâncias em extratos de baunilha de Bourbon, bem como em sabores de baunilha naturais e artificiais. O objetivo é comparar os ingredientes para obter a prova da autenticidade da baunilha Bourbon.

Ao aplicar o sistema analítico Knauer AZURA, um tempo de análise muito curto e um baixo consumo de eluentes poderiam ser alcançados. A alta velocidade e a confiabilidade do método tornam-se adequadas para análises de rotina no controle de alimentos.

A vanilina é um dos agentes aromatizantes mais populares utilizados em vários produtos alimentares e bebidas, bem como na indústria farmacêutica e de perfumaria. Com uma alta demanda pelo fornecimento de vagens de baunilha e pelo aumento contínuo do preço, agora estão disponíveis agentes aromatizantes de baunilha artificiais de origem sintética.

A baunilha artificial é um aldeído fenólico, obtido principalmente dos extratos das vagens de Vanilla planifolia, uma espécie das orquídeas de baunilha. Também é encontrado em café torrado e pinheiro vermelho chinês. Quimicamente, a vanilina é 4-hidroxi-3-metil benzaldeído.

 

Estruturas químicas dos analitos

Figura 1: Estruturas químicas dos analitos.

 

A alta demanda de vanilina excede em muito a oferta de todas as fontes de orquídeas de baunilha, que é o único sabor de baunilha cujo uso do nome “Bourbon vanilla” é permitido. O alto preço da vanilina natural, em comparação com a da vanilina sintética, e a sua baixa disponibilidade são os motivos da produção de vanilina via síntese química desde os idos de 1870. Esses processos usam coniferina, guaiacol ou eugenol como precursor.

Processos biotecnológicos como a fermentação que usam ácido ferúlico e farelo de arroz como precursores da vanilina são relativamente novos. A produção de vanilina produzida de forma biotecnológica é muito mais intensiva em custos que a vanilina sintetizada quimicamente, mas a UE permite que este produto use a designação de “sabor de baunilha natural”, enquanto o sabor sintetizado quimicamente deve usar o nome de “sabor de baunilha”. Algumas substâncias dos processos químicos ou biotecnológicos são indesejáveis ​​em produtos alimentares devido aos seus efeitos negativos para a saúde. Isso torna indispensável um controle analítico. Essas moléculas e os precursores utilizados na síntese química são marcadores apropriados para a diferenciação entre o sabor sintético de baunilha e o extrato de baunilha Bourbon. A análise desse tipo está recebendo cada vez mais atenção devido aos escândalos alimentares nos últimos anos.

Embora uma afirmação exata sobre a origem do sabor da baunilha só seja possível após métodos analíticos complexos como a análise isotópica, uma primeira afirmação sobre a origem do sabor da baunilha já é possível através do rastreamento de substâncias marcadoras usando métodos HPLC relativamente fáceis, econômicos e robustos. Portanto, neste trabalho, os extratos etanólicos de vagens de baunilha de Bourbon são comparados com sabores de baunilha sintéticos para encontrar substâncias marcadores para a origem do sabor.

 

Preparação Experimental de Amostras

Bourbon vanilla pode ser comprado em supermercados como um aditivo culinário. A vanilina pode ser facilmente extraída de vagens de baunilha de Bourbon usando um etanol como solvente. Para melhorar o processo de extração, a mistura é colocada em um banho ultrassônico e deixada para ser extraída durante a noite. Após filtração através de um filtro de seringa e diluição com a fase móvel, a amostra está pronta para análise por HPLC.

 

Tabela 1: Parâmetros da metodologia

ColunaBlueShell 80-2.6 C18A, 100 x 2mm
Eluente AWater + 0.05% TFA
Eluente BAcetonitrile/Water 80:20 (v/v) + 0.1% TFA
Gradiente
Time (min)% A% B
0.008515
0.506535
1.502575
1.700100
2.500100
Fluxo 0.8 mL/min
Volume de injeção 1 uL
Temperatura da coluna40ºC
Pressão do sistemaaprox. 600 bar
DetecçãoUV at 280 nm, 260 nm, 230 nm, and 3D data (50Hz)
Tempo de corrida5 min incl. column re-equilibration

 

Os padrões foram solubilizados e diluídos na fase móvel. O ácido 4-hidroxibenzóico, o ácido vanílico e o 4-hidroxibenzaldeído foram analisados ​​- além da vanilina – como substâncias tipicamente presentes no extrato de baunilha de Bourbon. Além disso, o guaiacol, etilvanilina, cumarina e eugenol foram analisados ​​como marcadores para sabor de baunilha sintética ou até mesmo aditivos indesejados.Preparação Experimental da Solução Padrão

 

Resultados

A Figura 2 mostra a sobreposição do padrão com uma amostra real de extrato de baunilha Bourbon. É óbvio que todas as substâncias podem ser separadas em menos de 2 min e apresentar picos muito definidos. Isso torna o método muito atraente para análises de rotina devido à sua velocidade. Alta resolução é alcançada pelo volume morto muito baixo do sistema de HPLC Azura e da coluna de núcleo sólido de alta resolução.

 

Figura 2: Cromatogramas a 280 nm, azul: padrão, verde: extrato de baunilha Bourbon.

 

A Figura 2 também mostra que no extrato de baunilha Bourbon as substâncias ácido 4-hidroxibenzóico, ácido vanílico, 4-hidroxibenzaldeído e vanilina foram encontradas como esperado. Ao mesmo tempo, as substâncias indesejadas guaiacol, etilvanilina, cumarina e eugenol não foram encontradas.

Os dados 3D foram adquiridos usando o detector DAD 6.1 L da Knauer. Isso permite que os espectros de cada substância sejam registrados para obter mais informações sobre a identidade dos picos ocorridos. A Figura 3 mostra os espectros registrados.

 

Figura 3: Espectro de padrões gravados com o DAD 6.1L.

 

Com base nesses resultados, foram analisados ​​um “extrato de baunilha Bourbon” e um sabor de baunilha sintético comercialmente disponível. No extrato de baunilha de Bourbon, os marcadores típicos para as vagens de baunilha podem ser encontrados enquanto os marcadores para o sabor sintetizado não foram ser detectados (veja a Figura 4).

 

Figura 4: Cromatogramas a 280 nm, azul: padrão, verde: sabor Bourbon Vanilla.

 

Figura 5: Espectro DAD, azul: 4-hidroxibenzaldeído, verde: pico desconhecido do sabor baunilha Bourbon em aprox. 1,3 min.

 

Além disso, o pico que elui em cerca de 1,3 min pode ser identificado como uma substância que pode ser análoga ao 4-hidroxibenzaldeído devido ao seu espectro. Para provar esta teoria, seria necessária uma análise adicional, como o acoplamento do HPLC a um espectrômetro de massa.

Para o sabor sintético da baunilha, os resultados foram completamente diferentes. Os marcadores para o extrato natural não foram detectados em quantidades significativas enquanto a quantidade relativa de vanilina em si era muito maior.

 

Figura 6: Cromatogramas a 280 nm, azul: padrão, verde: sabor artificial à baunilha.

 

O pico que eluir em cerca de 1,2 min merece atenção especial, porque ele elui muito próximo da cumarina, que é uma substância particularmente indesejada em produtos alimentares por causa de seus efeitos adversos para a saúde. O Instituto Federal Alemão de Avaliação de Risco (Bundesinstitut für Risikobewertung BfR) define uma ingestão diária tolerável de 0,1 mg/kg de peso corporal, que pode ser consumida ao longo da vida sem efeitos negativos para a saúde. A cumarina pode ser encontrada em quantidades significativas em feijões Tonka, que também possuem um forte sabor de baunilha e são usados ​​como uma fonte diferente de sabor de baunilha. Mais uma vez foram comparados os espectros DAD da cumarina e o pico do sabor sintético da baunilha. Da Figura 7 (a) é óbvio que a substância não é cumarina porque os espectros diferem em vários pontos.

 

Figura 7: Espectro DAD: (a): azul: cumarina, verde: pico de sabor artificial de baunilha em ca. 1,2 min. (B): azul: guaiacol, verde: pico do sabor artificial da baunilha em ca. 1,0 min.

 

A Figura 7 (b) mostra uma sobreposição dos espectros de guaiacol e a amostra a 1,0 min. A semelhança significa que é provável que seja a substância guaiacol, que é usado como precursor no processo de síntese de vanilina. Este é o processo estabelecido hoje para a síntese de vanilina e, portanto, a ocorrência desta substância na amostra não é surpreendente. Ao mesmo tempo, podemos ver esses resultados que o guaiacol é um bom marcador de vanilina sintetizada quimicamente.

 

Conclusão

O método de cromatografia líquida apresentado com detecção DAD é adequado para um rastreio rápido e fácil da origem dos sabores de baunilha em produtos alimentares. Usando equipamentos comparáveis ​​fáceis de manusear, econômicos e robustos, esse problema difícil poderia ser resolvido. As substâncias ácido 4-hidroxibenzóico, ácido vanílico e 4-hidroxibenzaldeído, bem como as suas concentrações relativas de vanilina, podem ser utilizados como marcadores para sabor a baunilha natural de Bourbon, enquanto que guaiacol, etilvanilina, cumarina e eugenol podem ser utilizados como marcadores para sabor de baunilha sintética. Guaiacol em particular, o precursor químico do processo de síntese de vanilina mais utilizado hoje, pode ser detectado no sabor da baunilha artificial.

 

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