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Purificação de xilitol de um purê de fermentação

A purificação de xilitol por cromatografia preparativa em batch indicou que o rendimento poderia ser aumentado através do uso de um método com  múltiplas colunas. Devido à natureza pseudo-binária da mistura a ser purificada, o processo com múltiplas colunas de cromatografia SMB pode ser aplicável. SMB é uma técnica de cromatografia líquida preparativa para separação de misturas binárias, que simultaneamente permite alta produtividade e alta pureza. Comparada à cromatografia líquida preparativa em batch, o processo por SMB faz um uso muito melhor da fase estacionária, resultando em um rendimento significativamente maior e um consumo significativamente menor de solvente. Já que a fase estacionária é usada mais efetivamente, os custos de material para a coluna também podem ser consideravelmente diminuídos.

Neste exemplo de purificação de xilitol, os esforços de desenvolvimento para a transferência do método preparativo em batch para a cromatografia SMB puderam ser bastante reduzidos quando comparados a projetos similares no passado.

A cromatografia líquida preparativa por Simulated moving bed (SMBC) foi aplicada à purificação de xilitol de um purê de fermentação de uma cultura de um lote alimentado. O processo permitiu que houvesse a purificação de xilitol perto de 100% de pureza e recuperação. Dessa forma, foi possível a purificação de xilitol em grande escala de um processo biológico de conversão xilose-xilitol.

INTRODUÇÃO

Dentro de um projeto de pesquisa da European Valor Plus, uma alternativa biológica de conversão de xilose estava sendo investigada. Usando-se a levedura Candida, xilose de hemicelulose hidrolisada foi convertida em xilitol. No Brasil diversos estudos a este respeito foram realizados em faculdades de Engenharia e Biotecnologia, retirando-se a hemiceluloses de fontes como bagaço de cana-de-açucar, palhas de cana, arroz e trigo, bagaço de maçã e cascas de aveia e café. A produção em escala aumentada também foi pesquisada, mas a purificação do xilitol ainda é um desafio.

A análise em HPLC do purê de fermentação revelou que a conversão de xilose em xilitol foi bem sucedida. Experimentos anteriores em HPLC indicaram um potencial para a aplicação de cromatografia preparativa por SMB a esta tarefa de purificação. A separação foi conseguida em uma coluna à base de polímeros Eurokat em modo isocrático e a substância-alvo xilitol diluída no fim do cromatograma, todos os fatores habilitando o uso da metodologia SMB.

Cromatografia SMB é uma técnica de cromatografia contínua que separa misturas binárias ou pseudo-binárias em substâncias puras ou frações. Comparado a cromatografia preparativa em batch tradicional, este processo leva a rendimentos maiores de substâncias purificadas enquanto consome menos eluente e material de empacotamento da coluna.

Fig. 1 Desenho do processo de cromatografia SMB de purê de fermentação com indicação de duas frações, refinado e extrato; 1mL de injeção; Coluna Eurokat Ca 150 x 20 mm, tamanho de partícula 25 -56 µm; 4 mL/min; 50°C

Fig. 2 Exemplo de esquema de uma configuração de um processo SMB com 4 bombas, as entradas e saídas, as 8 colunas, quatro zonas, indicação de vazão, pressão e tempo de circulação; software PurityChrom MCC

Fig. 3 Sobreposição de cromatogramas analíticos de refinado/ tudo menos xilitol (azul), extrato/xilitol (vermelho) e refugo (verde) do processo SMB no 6^o. ciclo; 20 µL injeção; Coluna + pré-coluna Eurokat Ca 300 x 8 mm; tamanho de partícula de 10 µm, 0.5 mL/ min; 75°C

MATERIAIS E MÉTODOS

A configuração padrão de SMB consiste em quatro AZURA® Assistants ASM 2.1L  com sete válvulas de múltiplas posições e quatro bombas P 4.1S (10 e 50mL/ min). A vazão foi controlada com dois medidores de fluxo CORI-Flow M13 e a temperatura com forno para SMB. Oito colunas idênticas Eurokat Ca 150 x 20 mm (Copolímero de estireno-divinilbenzeno sulfonado) com tamanho de partícula de 2556 µm foram usadas para purificação. A análise foi feita com colunas  Eurokat Ca 300 x 8 mm, tamanho de partícula de 10 µm e um sistema analítico dedicado para análise de açúcar.

CONCLUSÃO

Xilitol foi purificado com alto rendimento e pureza de um purê de fermentação usando-se um sistema AZURA® SMB. Este processo de purificação permite uma produção significativamente maior e, consequentemente, um maior rendimento de xilitol do que um processo clássico de cromatografia preparativa em batch. A produção real é limitada pela concentração de xilitol no purê original. O método desenvolvido é bastante robusto e a separação de purês duas a quatro vezes mais concentrado irá prover os mesmo resultados de separação.

RESULTADOS ADICIONAIS

Para a definição dos parâmetros do processo SMB, diversos parâmetros do processo de separação tiveram que ser determinados. Primeiro, a separação em três diferentes temperaturas (40°C, 50°C, 60°C) foi testada. A separação a 50°C deu os melhores resultados e por isso foi escolhida para o processo. Estudos de sobrecarga com uma diluição 1:2 do purê de fermentação revelaram uma separação próxima à linha de base do xilitol e manitol. O cromatograma foi dividido em fração refinada (tudo menos xilitol) e fração extraída (xilitol) (Fig.1).

Uma substância coeluindo com o tempo morto do sistema foi identificada e por isso um ciclo aberto foi escolhido com uma saída de refugo. Os tempos de retenção das substâncias e a porosidade da coluna foram determinados e usados como parâmetros do processo. Usando-se esses valores e o software PurityChrom® MCC, as vazões das bombas e as diferentes zonas dos processos foram obtidas (Fig. 2).  Depois de seis ciclos, amostras do extrato, refinado e refugo foram coletados e analisados. Um método analítico rápido (resultados adicionais Fig. A1) permitiram uma análise rápida do processo. Uma análise mais detalhada revelou xilitol puro no extrato sem qualquer contaminação  (Fig. 3, linha vermelha). Além disso, nenhum xilitol foi encontrado no refinado ou no refugo (Fig. 3 linhas azul e verde). Com esse processo SMB, 1,8 g/h de xilitol foram purificados com 100% de pureza e recuperação. O rendimento do processo de SMB é sete vezes maior que o do processo em batch.

Condições de separação

Fig. A1 Comparação dos perfis de separação de purê de fermentação usando colunas Eurokat Ca de diferentes tamanhos para um método analítico rápido; azul – 2 x 30 x 8mm (0.7mL/min), vermelho (offset=-200) -120 x 8mm (0.7 mL/min), verde (offset=-400) – 300 x 8mm (0.5 mL/min); 20 µL injeção; 75°C; * – xilitol, ** – manitol

Fig. A2 Cromatograma analítico de purê de fermentação mostrando 5 substâncias identificadas; 20 µL de injeção; Eurokat Ca 300 x 8 mm; tamanho de 10 µm; 0.5 mL/min; 75°C; 1 – xilose, 2 – arabinose, 3 – glycerol, 4 – mannitol, 5 – xilitol

Tab. A1 Resultados de análise de alimentação de informações apresentada em médias de 4 réplicas com desvios padrão indicados

Concentração (mg/ml)

Tab. A2 Parâmetros do método (processo SMB)

Tab. A3 Configuração do sistema e informações

Créditos: Yannick Krauke, Christian Benkhäuser, Matthias Lübbert, Kate Monks.