Esta aplicação demonstra como os sistemas de HPLC preparativos AZURA compactos e AZURA tradicional trabalham juntos em um processo completo de desenvolvimento de método, purificação e controle de pureza da Piperina a partir de extratos de pimenta preta.
O uso de uma coluna preparativa Eurospher II C18 com tecnologia de compressão axial permite que o método de HPLC preparativo seja robusto e confiável para o fracionamento da Piperina. Na sequência, a coluna de núcleo duro C8 clássico BlueShell mostra ao mesmo tempo a mais alta resolução para o controle de pureza em um sistema de HPLC clássico e barato com pressão de trabalho moderada.
Introdução
Pimenta preta (piper nigrum) é um tempero picante amplamente utilizado. Além disso, é utilizado na medicina tradicional. Confira alguns dados:
- A piperina é o principal composto que leva à bioatividade da pimenta preta e branca. Sua pungência foi estimada como 100000-200000 unidades Scoville.
- A piperina é um alcalóide e é a carboxamida do ácido piperico e da piperidina.
- Apresenta baixa solubilidade em água, mas o etanol e outros solventes orgânicos são adequados para solubilizar essa substância.
- Nas últimas décadas, a Piperina entrou no foco da pesquisa farmacêutica.
- Possui ação antibacteriana, antioxidante, antiinflamatória, e anti artrítica, entre outros efeitos.
- O ponto mais interessante é que a piperina aumenta a biodisponibilidade de vários fármacos terapêuticos e fitoquímicos.
- A concentração de piperina na pimenta preta e branca varia apenas de 3 a 8%. Por isso, é necessário um passo de purificação para a recuperação da piperina a partir da pimenta natural.
Nesta aplicação você irá encontrar a extração de acetona da Piperina da pimenta preta, o isolamento deste composto por cromatografia preparativa e, além disso, a análise de qualidade correspondente será demonstrada.
Preparação experimental de amostra
- A piperina foi extraída da pimenta usando-se acetona.
- Aproximadamente 6 g de pimenta preta moída foi pesada num balão adequado e adicionaram-se 50 ml de acetona (p.A.).
- O balão foi colocado em banho ultrassônico por 30 min a 60°C.
- Após cerca de 120 min, o pó sedimentou e o sobrenadante foi recolhido.
- Cuidando-se para não haver precipitação, 600µl de água foram adicionados a 1ml de extrato.
- Após filtração por filtro de 0,45µm, a solução estava pronta para ser injetada no HPLC.
O método de triagem foi desenvolvido com o objetivo de separar o pico-alvo da piperina da matriz. Ao mesmo tempo, o método tem que ser robusto e barato, porque será executado no modo preparativo e consumirá muito eluente após a etapa de escalonamento.
A coluna também precisa ser escalável para o tamanho preparativo. Com estas precauções, uma coluna Eurospher II C18 com 5 µm de tamanho de partícula foi escolhida e uma mistura de água com acetona foi usada como a fase móvel durante o desenvolvimento do método analítico.
A acetona não é comumente usada como eluente no HPLC, mas devido ao preço muito mais baixo comparado ao da acetonitrila ou metanol, foi neste caso escolhido como a fase móvel. Além disso, é um líquido muito volátil que simplificará a recuperação da Piperina purificada a partir da fase móvel preparativa.
O método resultante foi transferido para a escala preparativa, mantendo a fase estacionária e móvel idêntica e escalonando os parâmetros do método. O fator de aumento de escala é 25, aumentando de uma coluna de diâmetro interno de 4 mm até uma coluna de 20 mm preenchida com o mesmo material de coluna de 4 mm.
Após purificação da piperina via cromatografia preparativa, investigou-se a pureza da fração com um método de HPLC diferente. Neste caso, a coluna C8 clássica BlueShell foi escolhida, devido à sua alta resolução. A tecnologia de núcleo duro utilizada para essas partículas torna os picos bastante estreitos e, ao mesmo tempo, a pressão de trabalho tolerável.
Para o controle da pureza, a acetonitrila foi usada como a fase móvel, já que aqui o objetivo era obter a mais alta resolução e não a análise mais barata.
Parâmetros do método
Método de HPLC analítico para escalonamento para HPLC preparativo
| Coluna | Eurospher II 100-5 C18, 250 x 4 mm ID com precoluna integrada Eluente A Agua |
| Eluente | A Água B Acetona |
| Gradiente | Isocrático 60 % B |
| Vazão | 1,0 ml/min |
| Volume de injeção | 2 µl (resp. 40 µl para sobrecarga) |
| Temperatura da coluna | 25 °C |
| Detecção | UV a 210 nm e 340 nm, 10 mm célula de fluxo, 20 Hz, 0,05 s |
| Tempo de corrida | 14 min |
Método Preparativo para purificação de Piperina
| Coluna | Eurospher II 100-5 C18, 250 x 20 mm ID compressão axial com pré-coluna 30 x 20 mm |
| Eluente | A Água B Acetona |
| Gradiente | Isocrático 60 % B |
| Vazão | 25 ml/min |
| Volume de injeção | Aprox. 1000 µl (via bomba) |
| Temperatura da coluna | 25 °C |
| Detecção | UV a 340 nm, 3 mm célula de fluxo, 5 Hz, 0,02 s |
| Tempo de corrida | 14 min |
Método Analítico para controle de pureza
| Coluna | BlueShell classic 80-4.5 C8 core shell, 150 x 3 mm ID |
| Eluente | A Água B Acetonitrila |
| Gradiente | Isocrático 30 % B |
| Vazão | 1,0 ml/min |
| Volume de injeção | 5 µl |
| Temperatura da coluna | 25 °C |
| Detecção | UV a 201 nm, 10 mm célula de fluxol, 20 Hz, 0,05 s |
| Tempo de corrida | 20 min |
Resultados
A primeira análise foi executada para rastrear a coluna certa e os parâmetros do método que melhor se ajustavam para o HPLC preparativo.
A figura 2 mostra o cromatograma correspondente registrado com o método analítico otimizado: O traço azul mostra o cromatograma a 340 nm e o traço verde a 210 nm. O pico-alvo apresenta maior abundância a 340 nm e, portanto, esse comprimento de onda também foi escolhido na escala preparativa. Por outro lado, a maioria das impurezas são melhor detectáveis a 210 nm.
Isso se torna óbvio a partir do zoom-in da linha de base na fig. 2. Esta é também a razão pela qual o controle de pureza é recomendado em 210 nm.
Fig.2 | Legenda: Cromatograma analítico do extrato de pimenta (volume de injeção 2 µl) antes da purificação Coluna: Eurospher II 100-5 C18, 250 x 4 mm ID
Uma vez satisfeitos os resultados analíticos, o usuário é capaz de transferir o método facilmente para a escala preparativa. Isso significa que os parâmetros de sistema, coluna e método precisam ser ampliados. Antes da transferência, o volume de injeção foi ampliado no modo analítico. O cromatograma resultante com 40 µl de volume de injeção e com uma sobrecarga de coluna pode ser visto na figura 3.
Fig.3 | Legenda: Cromatograma analítico do extrato de pimenta com sobrecarga de coluna (40 µl injetado) antes da purificação usada para escalonar até o modo preparativo Coluna: Eurospher II 100-5 C18, 250 x 4 mm ID com pré-coluna integrada
Agora, o sistema preparativo HPLC AZURA e uma fase Eurospher II C18 preencheram o hardware KNAUER Vertex Plus AX com compressão axial. O cromatograma preparativo resultante pode ser visto na figura 4. As marcas indicam quando a fração de piperina foi coletada para atingir a mais alta pureza.
Fig.4 | Legenda: Cromatograma preparativo do extrato de pimenta para purificação de Piperina Coluna: Eurospher II 100-5 C18, 250 x 20 mm ID com pré-coluna 30 x 20 mm
A fração de piperina foi coletada usando uma válvula de seleção.
Para controlar a pureza desta fração, o próximo passo foi um método de HPLC de alta resolução usando a coluna de núcleo duro clássico BlueShell e o sistema compacto AZURA.
A maior resolução é necessária nesta etapa, porque todas as impurezas devem ser separadas do pico-alvo da piperina para descobrir a pureza da substância-alvo. O cromatograma do controle de pureza da fração de piperina pode ser visto na figura 5.
Fig.5 | Legenda: Cromatograma analítico da fração de Piperina depois da purificação pelo sistema de HPLC preparativo Coluna: BlueShell 80-4.5 classic C8, 150 x 3 mm ID
Para se ter uma comparação, a figura 6 mostra a sobreposição dos cromatogramas medidos antes (verde) e após purificação (azul) por HPLC preparativo. Torna-se óbvio que o extrato pode ser purificado em um grande intervalo via HPLC preparativo. Os tempos de retenção variam porque diferentes seletividades de coluna e diferentes parâmetros de método foram usados.
Fig.6 | Legenda: Cromatogramas analíticos registados em 210 nm antes (verde) e após purificação (azul) por HPLC preparativa
Verde: Coluna: Eurospher II 100-5 C18, 250 x 4 mm ID
Azul: Coluna: BlueShell 80-4,5 clássico C8, 150 x 3 mm ID
A fase clássica BlueShell com uma modificação C8 foi escolhida, porque resultou na melhor separação e com isso em um melhor controle de pureza da Piperina.
Com a primeira coluna C18 clássica BlueShell testada, havia ainda uma impureza eluindo ao mesmo tempo que a Piperina. Com a C8 modificada, a retenção foi muito melhor para a Piperina, o que pode ser facilmente visto na figura 6. A piperina elui depois, após cerca de 15 min, e é completamente separada de todas as impurezas. Como resultado, neste caso, o controle de pureza foi feito em uma coluna com seletividade diferente da usada para purificação.
Para se ter uma idéia exata de como funciona a etapa de purificação, a área de pico da piperina pode ser determinada e comparada com as áreas totais dos pico das impurezas.
- Para este método, a pureza resultante da Piperina foi superior a 81% com relação à área do pico.
- Para este cálculo, o pico de injeção resultante da acetona não foi considerado, porque a acetona pode ser facilmente evaporada após a purificação.
Conclusão
A linha AZURA é perfeitamente adequada para todas as análises que ocorreram durante o desenvolvimento do método preparativo.
Com o sistema AZURA compacto, o usuário pode facilmente executar análises na escala analítica para selecionar colunas que possam ser aplicadas na escala preparativa. Escalonando-se até ao HPLC preparativo AZURA, a purificação da piperina pode ser feita com uma execução bastante simples.
Os elementos AZURA combináveis ajudam o usuário a configurar um sistema perfeitamente adequado para a tarefa de separação individual. Após a etapa de purificação via HPLC preparativo e fracionamento do pico-alvo, um controle de pureza pode ser feito aplicando-se o mesmo sistema compacto AZURA usado antes durante o desenvolvimento do método.
O sistema é capaz de executar uma análise sensível e rápida da fração purificada de piperina. A aplicação de uma coluna C8 clássica do BlueShell resulta em picos muito estreitos e, com isso, a uma resolução muito boa e a limites de detecção baixos.
