Proteja sua coluna HPLC pra ela durar mais tempo!
Apesar de não ser parte integral do equipamento, filtros de entrada do solvente, filtros de entrada do injetor e da coluna, colunas de saturação e pré-colunas minimizam muitos problemas associados a separações complexas. Nós recomendamos que todas as amostras sejam filtradas por filtros de seringa de 0,45 µm ou 0,2 µm. O uso de pré-colunas integradas é fortemente recomendado também.
Filtros e pré-colunas evitam que partículas e componentes fortemente retidos se acumulem na coluna analítica. As partículas de sílica em uma coluna HPLC de saturação se dissolvem em fases móveis de pH alto, protegendo o enchimento à base de sílica na coluna analítica. A vida útil desses produtos descartáveis depende da composição da fase móvel, da pureza da amostra, do pH, etc. As colunas Knauer são produzidas em diferentes tamanhos e modelos. Uma grande variedade de enchimentos também está disponível, mas todos têm o mesmo propósito – a separação.
Confira nossas colunas nesse link.
O problema mais comum associado às colunas analíticas é a deterioração.
Isso é verdade, independentemente de a coluna ter fase reversa ou normal, troca iônica, afinidade, interação hidrofóbica, exclusão de tamanho e empacotamento baseado em resina ou sílica. Os sintomas de deterioração são formato ruim dos picos, picos indesejados, picos divididos, ombros, perda de resolução, diminuição dos tempos de retenção e aumento da pressão de trabalho. Estes sintomas indicam que contaminantes se acumularam nos frits ou entrada de colunas, ou existem vazios, canais ou depressões no enchimento.
A deterioração é mais evidente nas colunas de alta eficiência. Por exemplo, um enchimento de 3 µm protegido por frits de 0,5 µm é mais suscetível a entupimentos do que um enchimento de 5 ou 10 µm protegido por frits de 2 µm ou maior. A proteção adequada da coluna e a preparação da amostra apropriada são essenciais para que o máximo de cada coluna possa ser dado. A sobrecarga de uma coluna pode causar picos de formato ruim e outros problemas.
A capacidade da coluna depende de muitos fatores, mas os valores típicos são:
- Colunas analíticas (250mm x 4mm) 0.02 – 2.0mg
- Colunas semi-preparativas (250mm x 8mm) 0.08 – 8.0mg
- Colunas preparativas (250mm x 20mm) 0.5 – 50.0mg
Problemas de encaixe da coluna HPLC
Os vazamentos são um problema comum nas análises de HPLC e UHPLC. Para minimizar vazamentos no sistema, evite trocar peças e acessórios de diferentes fabricantes. Os encaixes incompatíveis podem ser forçados inicialmente a encaixar, mas depois de repetidas conexões, podem vazar.
Se a troca for absolutamente necessária, use adaptadores apropriados e verifique todas as conexões por vazamentos antes de prosseguir. Outro problema que ocorre quando há troca de peças por de outro fabricante é o aumento do volume morto (figura abaixo).
Especialmente em UHPLC, o volume morto deve ser minimizado para que se possa obter o alto desempenho requisitado do sistema.
Uma entrada de coluna entupida é outro problema comum de HPLC. Para minimizar este problema desde o início, use uma pré-coluna. Para limpar a entrada da coluna, primeiro desconecte e inverta a coluna. Conecte-a à bomba (mas não ao detector!), e bombeie o solvente em baixa vazão (0,5 ml/min). Cerca de 100 ml de solvente devem ser suficientes para desalojar pequenas quantidades de material particulado no frit de entrada da coluna. Se isso não funcionar, aumente a vazão cuidadosamente para 1 ml/min. Avalie o desempenho da coluna limpa usando uma amostra de picos conhecidos.
Recomendações especiais para análises com coluna em série
O acoplamento de colunas torna-se cada vez mais importante, pois é uma ferramenta útil para problemas complexos de separação. Em um sistema convencional de HPLC ou UHPLC, a análise com colunas em série pode ser facilmente arranjada sem nenhum equipamento adicional. Mas há alguns fatos que devem ser observados: especialmente no UHPLC, diminuir-se o volume morto é realmente importante.
Quando duas colunas são acopladas, capilares adicionais são necessários para conectar as colunas.
É óbvio que o capilar aplicado tem que ser tão curto e com o menor diâmetro interno possível. Se você não contar com isso, a separação realizada na primeira coluna pode ser novamente misturada no capilar. Para evitar este problema contraproducente, mantenha especialmente neste local os capilares mais curtos possíveis e com um pequeno diâmetro interno (0,1 mm ID, por exemplo, é típico para UHPLC).
Confira também os posts detalhados que estamos fazendo dos outros problemas do guia em nosso blog nesse link.
