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Aplicação HPLC | Análise de Micotoxinas em Grãos e Cereais

Você quer realizar a análise de micotoxinas de forma rápida, fácil e de alta resolução, sem a necessidade de usar um HPLC-MS-MS? Aqui, apresentamos não apenas uma aplicação para a determinação fácil e rápida de aflatoxinas, mas também uma solução de sistema tudo em um muito acessível.

As aflatoxinas são o grupo mais conhecido de micotoxinas produzidas como metabólitos secundários pelos fungos. Os principais são Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus, mas em menor grau também por outras cepas. Esta origem é também de onde vem o nome toxina Aspergillus flavus.

As micotoxinas podem entrar facilmente no mercado consumidor e representar um perigo para a saúde pública. Por isso, é importante desenvolver métodos analíticos eficazes para sua identificação e quantificação. O grande desafio, portanto, é que quantidades mínimas já são tóxicas e precisam ser detectados de forma confiável. As aflatoxinas ocorrem em diferentes alimentos e alimentos para animais, como por exemplo, cereais, nozes e produtos lácteos.

Na prática, isso significa que a análise de matrizes de amostras muito diferentes deve ser fácil e rápida. A análise é realizada com um sistema de HPLC que contém um reator fotoquímico UVE localizado logo após a coluna. Com este reator é realizada a chamada derivatização fotoquímica das aflatoxinas não visíveis para seus derivados fluorescentes.

Os empresários do ramo são obrigados por lei (RDC no7) a testar os alimentos. Garantir que os grãos e cereais distribuídos respeitem o limite máximo de micotoxinas permitidas é essencial, já que é impossível eliminar completamente sua presença. Testes quantitativos de análise de micotoxinas são realizados através de HPLC ou LC-MS-MS. Utiliza-se para preparo da amostra colunas de imunoafinidade e de limpeza para fase sólida disponíveis no mercado.

Instituições governamentais e agências de proteção da saúde aplicam esses métodos em larga escala para controlar produtos alimentícios comercializados e ração animal. Na indústria de processamento de alimentos, os mesmos métodos são usados para verificar matérias-primas e produtos.

Etapas analíticas para análise de micotoxinas

micotoxinas HPLC

Na etapa de preparação de amostra (etapa laranja), é necessário que haja a limpeza da amostra por uma coluna de imunoafinidade oude sílica (SPE). O passo seguinte (mostrado em azul no esquema) é a etapa de análise cromatográfica propriamente dita. Nessa aplicação utilizaremos a análise por cromatografia líquida com derivatização pós coluna.

 

Resultados da análise de micotoxinas

No cromatograma a seguir você encontra a separação de quatro aflatoxinas típicas de amostras de nozes e cereais. A detecção ocorreu com a ajuda de derivatização pós-coluna usando um fotoreator UVE.

Os picos foram bem separados e mostraram um bom formato. Além disso, o tempo de execução foi curto, permitindo que a análise de micotoxinas seja rápida.
Compara-se no cromatograma as linhas verdes e azul (com derivatização pós-coluna e sem, respectivamente). A derivatização fotoquímica leva a picos mais altos e mais nítidos quando comparado com a análise sem a derivatização. Este método também é adequado para a determinação da aflatoxina M1 a partir do leite.

Materiais e Métodos

As amostras de nozes e cereal foram primeiro homogeneizadas numa mistura de metanol/água e então foram filtradas. O filtrado foi dissolvido numa solução aquosa e desengordurado com hexano. Após extração com clorofórmio e subsequente concentração, o extrato foi aplicado a um cartucho de SPE.

A etapa de eluição foi realizada com clorofórmio/acetona para que a amostra esteja pronta para ser injetada no sistema de HPLC. A análise é feita através de um método clássico de HPLC numa coluna C18 (Eurospher II 100-3 C18, 250 x 3 mm ID). Foi usado um método de gradiente com água e acetonitrila como eluente. A detecção é feita com um detector de fluorescência (ex 365 nm / em 455 nm). Além disso, foi usada a derivatização pós-coluna com o fotoreator UVE, para diminuir o limite de detecção de aflatoxina B1 e G1.

Conclusão da análise de micotoxinas

Utilizando o fotoreactor UVE para derivatização pós-coluna em combinação com um método HPLC no sistema AZURA Analytical e uma coluna Eurospher II C18, foi de forma muito fácil analisar todas as quatro aflatoxinas.

A fase móvel não é alterada para este método de derivatização pós-coluna, de forma que a análise de outras substâncias não é afetada. Como os picos foram bem separados com alta resolução, também seria possível analisar ainda mais micotoxinas no mesmo método.

Concluímos que o UVE é altamente recomendável para a análise rápida e fácil de micotoxinas a partir de matrizes de alimento, não tendo que depender de equipamentos caros como o MS.

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