HIC OU HILIC?
Em dúvida sobre qual a melhor coluna cromatográfica para sua necessidade de análise? Vamos tratar nesse post sobre as diferenças, vantagens e desvantagens entre as colunas HIC e HILIC. Acompanhe:
Princípios básicos:
Primeiramente, vamos relembrar os princípios básicos de cada método:
HILIC – Cromatografia de Interação Hidrofílica
“HILIC Proporciona retenção dos analitos hidrofílicos altamente polares que são difíceis de reter em métodos RP utilizando combinações simples de fase celular e fase estacionária.”
“Uma fase estacionária altamente polar, muitas vezes sílica nua, é usada em grande parte com um sistema de fase móvel não polar (a água atua como um solvente muito forte em HILIC)”
É um método muito poderoso para LC-MS.
HILIC é uma tecnologia de separação importante, quando outras técnicas chegam ao limite.
HIC – Cromatografia de interação hidrofóbica
A separação de substâncias é baseada na sua força variável de interação com grupos hidrofóbicos ligados a uma matriz de gel não carregada.
Grupos hidrofóbicos em proteínas estão suficientemente expostos para se ligar aos grupos hidrofóbicos na matriz.
Vantagens HIC:
- Grande volume de amostra
- Amostras com fortes forças iónicas
- Bom antes da filtração por gel (SEC), troca de ions
- (IEX) ou cromatografia de afinidade
- Amostra eluída com baixo teor de sal
HIC – parâmetros de influência
- O tipo de ligando hidrofóbico afeta a absorção de proteína – a interação pode não ser estritamente hidrofóbica
- A escolha do ligando é bastante empírica
- A capacidade de ligação da proteína à superfície HIC aumenta com o comprimento da cadeia de alkyl (A) e o aumento do grau de substituição do ligando imobilizado (B)
- Proteína pode ligar multiponto e, então, é difícil de eluir!
- O tipo de matriz base também é importante – amplamente utilizados são: agarose reticulada (como BioFox) e materiais de copolímero sintético
- Pode ser necessário modificar as condições de adsorção e eluição – tome conhecimento dos protocolos
- A ligação de proteínas pode ser vista como “salgar”. Mais sal = mais ligado a proteínas
- As proteínas ligadas são separadas lavando a coluna HIC com tampão neutro, diluído ou mesmo com água
- Diminuição do pH aumenta a ligação
HIC usa seções hidrofóbicas de proteínas; HILIC não é adequado para proteínas completas, mas para péptidos
Protocolos HIC e HILIC
- Para compostos altamente carregados, é necessária pelo menos uma baixa concentração de sal (10mM) para compensar (supressão de íons)
- Os protocolos HIC começam com concentrações de sal ainda maiores e usam um gradiente de sal decrescente para separação!
HIC – Onde ele se encaixa?
- AC – SEC
- AC – IEC – SEC
- IEC – HIC – SEC
- HIC – IEC – SEC
Agora você já sabe onde essas técnicas se complementam e não precisa ter dúvidas na hora de escolher entre elas!
Veja alguns exemplos de análises com as duas técnicas nessa apresentação.
Fonte: Mark Woodruff em LC GC a coluna. Os Ins e Outs of HILIC Chromatography 24 de janeiro de 2011, Vol.7, questão 1 | Fonte: Mark Woodruff em LC GC, a coluna. Os Encomendados da Cromatografia HILIC - 24 de janeiro de 2011, Vol.7, edição 1
