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Diretrizes de desenvolvimento de métodos HILIC – Interação Hidrofílica de Cromatografia Líquida

O que é HILIC?

Diretrizes de desenvolvimento de métodos HILIC - Interação Hidrofílica de Cromatografia LíquidaInteração Hidrofílica de Cromatografia Líquida, ou HILIC, é a cromatografia de fase normal de compostos polares iônicos sob condições de fase reversa.

O mecanismo principal de separação é constituído por uma camada aquosa construída na fase estacionária e pela partição dos analitos entre a fase estacionária muito polar e a fase móvel menos polar. Isto leva ao retardo de compostos polares e hidrofílicos, como por exemplo, o Uracilo, que é utilizado como um marcador de tempo morto não retardado em HPLC de fase reversa. Compostos polares como Tolueno, por exemplo, não são retardados e podem ser usados como um marcador de tempo morto em HILIC.

Isto resulta no método HILIC mostrar uma ordem de eluição que é muitas vezes inversa comparada com separações de fase reversa.

Força relativa do solvente no modo HILIC: Acetona < Acetonitrila < Isopropanol < Etanol < Metanol < Água

O mecanismo de retenção HILIC

Os mecanismos de retenção em HILIC são complexos e levam a diferentes padrões de retenção em diferentes fases estacionárias HILIC. Os principais mecanismos são a partição entre uma camada rica de água sobre a superfície da fase estacionária e a fase móvel orgânica enriquecida, adsorção específica de grupos funcionais polares na fase estacionária, a retenção iônica em grupos ionizados ou em grupos silanol ionizados na base sílica e retenção de fase reversa nas porções hidrofóbicas dos grupos ligantes.

Uma diferença significativa entre as colunas HILIC é se elas dependem principalmente da adsorção e da ligação de hidrogênios, ou da partição hidrofílica e de interações em diversos pontos.  Todas as colunas de sílica simples apresentam seletividade de adsorção, enquanto colunas zwiteriônicas geralmente exibem o padrão de seletividade que pode ser atribuído à partição. Com as fases das colunas Eurospher II HILIC e Bluespher HILIC, a Knauer oferece uma fase HILIC modificada de ácido amônio-sulfônico. Esta é uma modificação especial zwiteriônica com superfície altamente polar mas com carga neutra. Fases de sílica, amino, diol e ciano também são muito utilizadas para separação HILIC.

O desenvolvimento do método – Informações para começar

Como no desenvolvimento de métodos de fase reversa, as primeiras informações sobre os analitos devem ser coletadas para estimar o potencial para o método HILIC e para encontrar os parâmetros iniciais corretos para o desenvolvimento do método. Quando o Coeficiente de Partição LogP está disponível para o analito, ele dá uma boa idéia da aplicabilidade do HILIC para esse caso. Se o LogP está perto ou abaixo de zero, o método HILIC vai funcionar muito bem. A Constante de Dissociação de Ácido pKa é também um fator importante. O pKa nos dá a informação sobre a habilidade da molécula em aceitar ou doar prótons quando sujeitos ao pH da fase móvel. É um fator importante escolher a fase estacionária certa.

Eluentes típicos são compostos de 40- 98% de acetonitrila em água ou um tampão volátil. É recomendável o uso de eluição isocrática com a metodologia, mas algumas vezes pode-se usar gradiente. Aqui também o gradiente vai se apresentar na direção oposta do modo de fase reversa. A polaridade da fase móvel vai ser aumentada através do decréscimo do solvente orgânico.

É importante notar que as fases HILIC são em geral menos toleráveis a gradientes rápidos e precisam de tempos de equilíbrio mais longos do que as fases de fases reversas. Este fenômeno se deve à camada aquosa na fase estacionária, que é dependente da composição da fase móvel. Por esta razão, os gradientes HILIC também não devem ser trabalhados de 0% a 100% de fase aquosa. Nunca utilize menos de 2% de fase aquosa para garantir a hidratação suficiente da fase estacionária. Se for necessário separar solutos com ampla diferença de fatores de retenção durante a mesma corrida, usar um gradiente linear de 90% a 40% de acetonitrila como um ponto de partida.

Fluxo para o desenvolvimento de uma metodologia HILIC.

Siga este guia e você terá um bom começo para a sua separação HILIC:

 


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