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Diretrizes de desenvolvimento de métodos HILIC – Interação Hidrofílica de Cromatografia Líquida

O que é HILIC?

Interação Hidrofílica de Cromatografia Líquida, ou HILIC, é a cromatografia de fase normal (NP) de compostos polares iônicos sob condições de fase reversa (RP).

O mecanismo principal de separação é causado por uma camada aquosa construída na fase estacionária e pela partição dos analitos entre a fase estacionária muito polar e a fase móvel menos polar. Isto leva ao retardo de compostos polares e hidrofílicos, como por exemplo, o Uracilo, que é utilizado como um marcador de tempo morto não retardado em HPLC de fase reversa. Compostos polares como Tolueno, por exemplo, não são retardados e podem ser usados como um marcador de tempo morto em HILIC.

Isto leva HILIC a ter uma ordem de eluição que é muitas vezes inversa em comparação com separações de fase reversa.

O mecanismo de retenção HILIC

Os mecanismos de retenção em HILIC são complexos e levam a diferentes padrões de retenção em diferentes fases estacionárias HILIC.

Os principais mecanismos são a partição entre uma camada rica de água sobre a superfície e a fase orgânica móvel enriquecida, adsorção específica de grupos funcionais polares na fase estacionária, a retenção iônica em grupos ionizados ou em silanóis deionizados da base sílica e retenção de fase inversa sobre as porções hidrofóbicas dos ligantes ligados.

O desenvolvimento do método HILIC – Informações Iniciais

Como no desenvolvimento de métodos RP (Fase Reversa), as primeiras informações sobre os analitos devem ser recolhidas para estimar o potencial de um método HILIC e encontrar o jeito correto de iniciar parâmetros para o desenvolvimento do método.

Uma boa ideia sobre a usabilidade de HILIC, é quando o Coeficiente de Partição LogP está disponível para o analito. Se LogP está perto de zero ou mesmo abaixo, HILIC vai funcionar muito bem.

A dissociação do ácido constante pKa é também um fator relevante. Dá-nos informações sobre a capacidade da molécula para aceitar ou libertar prótons sujeitos ao pH da fase móvel.

Outro fator importante é escolher a fase estacionária certa.

As fases HILIC são em geral menos toleráveis para gradientes rápidos e precisam de tempos de equilíbrio mais longos do que as fases de Fases Reversas. Isto é causado pela camada aquosa na fase estacionária, que é dependente da composição da fase móvel. Por esta razão, os gradientes HILIC também não devem ser executados a partir de 0% a 100% de fase aquosa. Nunca utilizar fase aquosa inferior a 2% para assegurar uma hidratação suficiente da fase estacionária. Se for necessário separar solutos com ampla diferença de fatores de retenção durante a mesma execução, usar um gradiente linear de 90% a 40% de acetonitrila como um ponto de partida.

Veja esse fluxo completo que irá ajudá-lo durante o desenvolvimento de método no modo HILIC.

 


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