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Aplicação FPLC: Separação de duas proteínas com Cromatografia de Troca Iônica

A cromatografia de troca iônica é uma das técnicas de FPLC mais usadas para separação e purificação de proteínas. Esta aplicação descreve uma separação muito simples de duas proteínas diferentes e explica como a cromatografia por troca iônica funciona.

pI (Ponto Isométrico) e pH

A cromatografia de troca iônica (IEC) separa moléculas de acordo com o tipo e força de sua carga elétrica. O ponto isoelétrico (pI) é definido pelo pH em que a proteína ou molécula não tem nenhuma carga elétrica. A carga superficial da proteína depende do pH da solução na qual ela está eluída.

Quando a solução possui um pH acima do seu pI, as proteínas tem uma carga negativa e se ligam a resinas aniônicas carregadas positivamente. Já no caso do pH da solução estar abaixo do seu pI, as proteínas carregam carga positiva e se ligam a resinas catiônicas carregadas negativamente.

Esta interação elétrica através do pH é usada para a separação e purificação de diversas proteínas. Através do uso de um pH conveniente e baixa concentração de sal, as proteínas se ligam à resina da coluna no passo inicial (Figura 1A). Em seguida, de forma geral, as proteínas são desconectadas da resina da coluna quando submetidas à um gradiente linear de uma solução salina. Os íons do sal competem com as proteínas pelos sítios ativos da resina.

Proteínas com interações iônicas fracas são as primeiras a eluir da coluna. No caso de cromatografia de troca catiônica, as proteínas com cargas negativas mais fracas são as primeiras a eluir (Figura 1B). Com um aumento na concentração do sal, as proteínas com interações mais fortes eluem da coluna (Figura 1C).

 

Resultados da troca iônica

α-Chimotripsinogeno A (pI 8,97) e Lisosima (pI 11,35) são proteínas que têm alto pI, o que as torna candidatas ideais para a cromatografia de troca catiônica (Figura 2). Ambas proteínas se ligam sob baixa concentração salina à resina. Durante o passo de lavagem, que remove proteínas não ligantes potenciais, só uma pequena quantidade de impurezas eluíram da coluna. α-Chimotripsinogeno A eluiu primeiro da coluna devido ao seu pI mais baixo de 8,97 (Figura 2, pico 1).

Com um gradiente incremental e, portanto, um aumento incremental na concentração salina, a Lisosima eluiu como mostra o segundo pico (Figura 2, pico 2). As proteínas eluídas foram coletadas de forma automática no coletor de frações. O gradiente de sal foi monitorado por um condutivímetro (Figura 2, sinal vermelho).

 

Figura 1:

Princípio de separação catiônica
A) proteínas com cargas negativas diferentes se ligam a resina de troca catiônica,
B) através do incremento da concentração de sal, proteínas com carga negativa mais fraca eluem primeiro,
C) quando a concentração de sal aumenta, as proteínas com cargas negativas mais fortes eluem por último.

 

 

 

 

 

 

Figura 2:

Cromatograma de uma separação de dois tipos de proteínas com cromatografia de troca iônica, linha azul – sinal UV 280nm, linha vermelha – sinal do condutivímetro,
1) pico contendo α-Chimotripsinogeno A (2,5 mg/mL),
2) pico contendo Lisosima (2,5mg/mL)

 

 

 

 

Materiais e Métodos

Nesta aplicação, foi utilizado um sistema de purificação AZURA® Bio composto de:

  • Uma bomba AZURA® P 6.1L LPG livre de metais com um cabeçote de 10mL;
  • Um assistente AZURA® ASM 2.1L com bomba de alimentação e duas válvulas de injeção;
  • Um detector de arranjo de diodos AZURA® DAD 2.1L com 10mm, célula de fluxo de 10µL;
  • Um monitor de condutividade AZURA® CM 2.1S;
  • Um coletor de frações Foxy R1.
  1. Antes da corrida, a coluna de troca catiônica de 1mL (HiTrap Capto S) foi equilibrada em 10mL do tampão A (tampão fosfato 20 mM, pH 7.1). A vazão para a corrida foi 2mL/min.
  2. A mistura de proteína de 500µL (α-Chimotripsinogeno A 2,5mg/mL + Lisosima 2,5mg/mL) foi injetada.
  3. Em seguida a coluna foi lavada com 4mL de tampão A para remover toda a proteína não ligante.
  4. As duas proteínas foram eluídas com um gradiente linear ao longo de um volume total de 70 mL. A concentração de sal aumentou com o aumento da concentração do tampão B (tampão fosfato 20mM, pH 7.1 + 1M NaCl) no gradiente de 0% a 30%.
  5. As proteínas que eluíram foram coletadas pelo coletor de frações.
  6. A coluna foi regenerada com uma lavagem de alta concentração de sal com 6mL de tampão B, a seguir um reequilíbrio da coluna com 10mL do tampão A.
  7. As proteínas foram detectadas a 280nm e o sinal de condutividade foi registrado para monitorar o gradiente de sal.

 

Conclusão

Esta aplicação bem direta ilustra o princípio da cromatografia de troca iônica. Dois tipos de proteínas com diferentes cargas superficiais eluíram da coluna de troca catiônica quando submetidas à uma concentração crescente de sal. As proteínas puderam ser facilmente separadas pela cromatografia de troca catiônica com um sistema de purificação AZURA® Bio.

 

Materiais Adicionais e Parâmetros

 

Tabela A1: Parâmetros do método

Eluente A20 mM tampão fosfato pH 7.1
Eluente B20 mM tampão fosfato pH 7.1 + 1 M NaCl
GradienteVolume [mL]                  % A                      % B
0                                         100                       0
4                                         100                       0
74                                       70                         30
74.02                                 0                          100
80                                      0                          100
80                                      100                       0
90                                      100                       0
Vazão2 mL/min
Tempo corrida45 min
Temperatura da coluna25°C
Modo de injeçãoFull loop
Volume de injeção0,5 mL
Data rate2 Hz
Comprimento de onda280 nm
Constante de tempo500 ms

 

Tabela A2: Configuração do sistema e informações

InstrumentoDescrição
BombaAZURA P 6.1L LPG, livre de metal
DetectorAZURA DAD 2.1L
Célula de fluxo10mm, 10µL, Ti, 300bar
AssistenteAZURA ASM 2.1L
Esquerda: Bomba com sensor de pressão, 50 mL cabeçote, titânioMeio: válvula de injeção de 6 portas/ 2 posições, conectores 1/16″Direita: válvula de injeção de 6 portas/ 2 posições, conectores 1/16″
Coletor de fraçõesFoxy R1
CondutivímetroAZURA CM 2.1S
ColunaCapto S, GE Healthcare, HiTrap, 1mL
SoftwarePurityChrom 3D Option

 

Baixe aqui a aplicação completa.

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